一、細胞永生化介紹、

  細胞永生化（Cell immortalization）是指體外培養的細胞經過自發的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。正常組織來源的細胞在通常的體外培養條件下可分裂生長，但經過有限次數的傳代后，就會停止增殖，發生衰老和死亡。利用基因轉染等技術將外源性永生化基因導入目的細胞內，從而建立永生化細胞株，以達到使體外培養的細胞具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的。對細胞永生化進行深入研究，不僅有利于我們了解細胞增殖與衰老的分子機制，而且為探尋腫瘤治療及器官移植的研究奠定了堅實的基礎。此外，由于永生化細胞具有可以多次傳代的特性，可以利用各種細胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖緩慢、容易衰老的細胞獲得永生，從而為研究人員提供更多的細胞資源。

二、永生化細胞株的建立方法

  由于體外培養細胞自發性永生化率非常低，目前普遍采用基因轉染技術將外源性永生化基因導入目的細胞內, 以增加永生化。永生化相關的外源基因。

以SV40過表達慢病毒為例：

1．轉染

（1）將細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×105 個，

（2）第二天，待細胞貼壁后，換液，

（3）加入1mL完全培養基，再加20 μL SV40過表達慢病毒，

（4）混勻后繼續培養，

（5）12h后觀察細胞狀態，并更換為新鮮培養基，

（6）當細胞長滿板底后，傳代至T25培養瓶中。

2.篩選

2.1殺滅曲線的確定

（1）將未轉染的干細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養基加入已鋪有細胞的24孔板，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀察細胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內殺死所有細胞的最低篩選濃度。

結果：嘌呤霉素的使用濃度為2ug/mL，作用時間為3d。

2.2嘌呤霉素篩選轉染細胞

（1）第一天，將轉染的細胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養基，

（3）加入含嘌呤霉素（2ug/mL）的篩選培養基，孵育，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養基，

（5）每天觀察細胞的存活比例，

（6）在同一時間點（3d）存活的細胞，即為轉染成功的細胞，

（7）對篩選后的細胞進行擴增。

三、詢價及訂購

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