1) 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時(shí)，可進(jìn)行凍存。

2) 在生物安全柜內(nèi)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶瓶口，收集瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基；

3) 向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入3ml無(wú)菌的 1×PBS 后，水平放置培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤(rùn)到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積，吸棄 PBS；

4) 向瓶?jī)?nèi)加入消化液1ml，浸潤(rùn)底面后放入 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中孵育 1~2min；

5) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，若全部消化下來(lái)則直接向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入

注：如還有部分細(xì)胞未消化下來(lái)，可采用分步消化：2ml 含10%FBS 的培養(yǎng)基（這里的培養(yǎng)基可以用DMEM就行或者其他的基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中，將懸液吸入15ml 離心管；

① 準(zhǔn)備一個(gè)無(wú)菌的 15ml 離心管，加入 2ml 含 10%FBS 的培養(yǎng)基；

② 將消化下來(lái)的細(xì)胞吸入①中的離心管內(nèi)中和（避免吹打）；

③ 向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右，輕拍培養(yǎng)瓶，95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養(yǎng)基中和，中和后的細(xì)胞懸液移入①中的離心管內(nèi)。

6) 1000rpm 離心 5min；

7） 離心完成后，棄上清，用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中；

8） 將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過(guò)夜降溫；

9） 第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。